用户文章Nat Comm-外泌体TGF-β1对白念珠菌免疫应答

论文标题：Immune modulation by complement receptor 3-dependent human monocyte TGF-β1-transporting vesicles

刊登日期：2020年5月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：12.121

研究机构：德国莱布尼兹研究所

开展项目：外泌体labelfree蛋白组、转录组测序

摘要

细胞外泌体在细胞通讯中起重要作用。在这里，作者发现人类和小鼠的单核细胞释放对病原性真菌白色念珠菌的TGF-β1转运囊泡/外泌体。

来自白色念珠菌的可溶性β-葡聚糖与单核细胞上的补体受体3（CR3，也称为CD11b / CD18）结合，并诱导TGF-β1转运小泡的释放。使用由CRISPR-CAS9基因组编辑生成并从CR3- deficient（CD11b敲除）小鼠中分离的CR3 deficient（CD11b敲除）单核细胞证明了CR3重要性。

这些外泌体减少了人类M1巨噬细胞以及全血中的促炎反应。外泌体中运输的TGF-β1与TGF-β受体的结合通过全血中的SMAD7途径抑制IL1B转录，并诱导内皮细胞中的TGFB1转录，这在TGF-β1抑制后得以解决。

值得注意的是，人补体调理的凋亡小体在单核细胞中诱导了类似的TGF-β1转运小泡的产生，这表明早期的免疫反应可能通过这种依赖CR3的抗炎小泡途径被抑制。

1. 白色念珠菌诱导人血单核细胞释放囊泡

白色念珠菌诱导人血单核细胞释放小泡

2. MEVsCa是双层囊泡

使用聚合物沉淀法分离了分离的人血单核细胞响应调理白色念珠菌而产生的MEVsCa，单核细胞在被真菌感染后释放出更多的囊泡，大小范围为50至450 nm。

此外，对分离的外泌体进行labelfree检测（联川生物提供labelfree外泌体蛋白组质谱及生信分析服务）。与MEV相比，MEVsCa中有361种蛋白显著增加，而29种蛋白的丰度显著降低。GO富集分析表明，MEVsCa中具有较高丰度的大多数蛋白质（209）是细胞外泌体相关蛋白质。

在MEV和MEVsCa中发现了热休克蛋白，以及在囊泡中常见的组蛋白片段。在MEVs和MEVsCa中都存在CD14，证实了它们的单核细胞起源。

此外，MEVsCa中的髓系谱系标志物，例如CD11b，I型补体受体（CR1）和Toll样受体2（TLR2）分别增加了2倍，8倍和11倍。在MEVsCa中还鉴定了四跨膜蛋白CD9以及常见的膜联蛋白。

KEGG富集分析显示，生理上重要的补体途径蛋白含量很高。由于细胞因子是免疫系统的重要调节剂，并且很难通过质谱检测。因此，MEV和MEVsCa中的细胞因子水平可通过夹心ELISA确定。

在源自受感染单核细胞的MEVsCa中检测到大量转化生长因子-β1（TGF-β1），但在源自相同数量未感染单核细胞的MEV中未检测到。

相反，IL-6、IL-10和IL-1β的水平非常低或没有被检测到。为了排除囊泡聚合物沉淀中的细胞外蛋白，通过超速离心和尺寸排阻色谱分离的囊泡分析也证实了这一结果。此外，通过尺寸排阻色谱法在TGF-β1转运囊泡（70-130 nm）上鉴定了囊泡标志物CD9和HSP90，此外，将这些囊泡定义为外泌体。同时使用不同的抗体可以解释存在少量没有囊泡标记物的TGF-β1转运囊泡。

3. MEVsCa转运TGF-β1

为了在生理条件下观察MEVsCa，还使用活细胞成像和CLSM在白色念珠菌感染的全血中离体追踪了MEVsCa。随着时间的流逝，使用抗CD14标记追踪单核细胞，使用抗TGF-β1标记追踪囊泡。感染1小时后，与未感染的血液相比，血液中检测到的TGF-β1转运囊泡（BEVsCa）数量明显增加、

与未处理的对照小鼠的血液相比，感染小鼠血液中的TGF-β1转运小泡显着增加了。

还通过阳性选择纯化了TGF-β1转运囊泡，分析显示四个不同的囊泡种群范围为30至350nm，主要种群位于100nm以下。从选定的TGF-β1转运小泡中分离出CD9转运小泡，得到一部分CD9加TGF-β1转运小泡。这些结果证实了TGF-β1在囊泡上的存在。

4. 真菌β-葡聚糖与CR3相互作用诱导MEVsCa释放

为了确定如何生成运输TGF-β1的MEVsCa，集中研究了CR3，因为CR3被描述为病原体的关键识别受体。

流式细胞术和WB表明，CD11b敲除THP-1细胞失去了CR3的表达。然而，CD11b KO THP-1细胞完全无法释放含TGF-β1的囊泡。

当使用富集的可溶性β-葡聚糖代替同一PLA中的整个白色念珠菌细胞时，证实了可溶性β-葡聚糖与CD11b之间的相互作用。在不存在可溶性β-葡聚糖的情况下，仅从表达CR3的单核细胞中未检测到荧光。

Labelfree蛋白质组学（联川生物提供labelfree外泌体蛋白组质谱及生信分析服务）证实与MEV相比，MEVsCa-sβG显著增加了420种蛋白，而13种蛋白质的水平则显著降低。

GO富集分析再次鉴定出的大多数蛋白质（238）是细胞外泌体相关的蛋白质，类似于在整个白色念珠菌诱导的囊泡中鉴定的蛋白质。KEGG富集分析还显示补体途径蛋白含量很高。

此外，在100种常见报道的囊泡标记（ExoCarta）中，两种囊泡（MEVsCa和MEVsCa-sβG）中的68种均被上调。

这些数据证实可溶性β-葡聚糖是诱导念珠菌TGF-β1转运囊泡的白色念珠菌的组分。

5. 凋亡小体诱导释放TGF-β1的MEV释放

从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）产生凋亡小体，将其分离，在补体活性人血清中调理后，与人血单核细胞孵育1小时。分离对调理的凋亡小体（MEVsAB）诱导的囊泡，并通过ELISA测定TGF-β1。与MEV相比，凋亡小体诱导的TGF-β1转运小泡（MEVsAB）的量明显更高。

在辛伐他汀的存在下将凋亡细胞在全血中孵育，这会阻断CR3的活化。在这些条件下，BCEVsAB中TGF-β1的量显着减少，并且与缺少凋亡细胞的BCEVs中的水平相当。

CD11b KO小鼠单核细胞产生的BCEVs和BCEVsAB之间的TGF-β1含量没有显着差异，但野生型单核细胞产生的BCEVsAB与BCEVs相比，TGF-β1水平显着增加。

因此，单核细胞响应于凋亡小体而以CR3依赖性方式释放含TGF-β1的囊泡，并且该途径也被白色念珠菌使用。

6. MEVsCa下调人类巨噬细胞中IL-6的表达

为了抑制炎症，囊泡上的TGF-β1与巨噬细胞上的TGF-βRII相互作用。因此，通过PLA评估了TGF-β1转运小泡与该受体的结合。共同孵育揭示了囊泡上的TGF-β1和巨噬细胞上的TGF-βRII之间的复合物形成，而MEV则与PLA中的TGF-βRII没有任何相互作用。

当囊泡上的TGF-β1被TGF-β1中和抗体阻断时，LPS诱导的IL-6并未降低，证实了TGF-β1囊泡的抗炎作用。

7. MEVsCa通过SMAD7途径减轻炎症

感染和使用TGF-β1中和抗体后，未检测到IL-6转录的变化。当TGF-β1用免疫金标记时，观察到TGF-β1转运囊泡，尤其是在白色念珠菌菌丝上。通过SDS-PAGE分离蛋白质并进行免疫印迹以检测TGF-β1途径激活，包括磷酸化的SMAD2 / 3和SMAD7。SMAD7在白色念珠菌感染期间上调，并在存在抗TGF-β1抗体的情况下降低。

转录组测序（联川生物提供建库测序及生物信息分析服务）表明，SMAD7和NFKBIA以及SMAD2显着上调。

在白色念珠菌感染的小鼠全血中证实了TGF-β1转运小泡的调节作用。在早期感染的野生型小鼠血液中观察到了TGF-β1转运小泡的释放，IL1b转录没有明显上。相反，在感染的CD11b KO血细胞中没有释放出TGF-β1转运小泡，但IL1b转录的高表达。

8. MEVsCa对内皮细胞起抗炎作用

总而言之，这些结果表明，在体外和体内，TGF-β1转运囊泡响应白色念珠菌而释放，附着在内皮细胞上并上调了TGF-β1的表达。

作者本文中描述了人类单核细胞对白色念珠菌真菌感染的早期作用，先前未描述的免疫反应。由于可溶性白色念珠菌来源的β-葡聚糖与宿主单核细胞上的CR3结合，因此单核细胞形成并释放转运TGF-β1的囊泡。

响应于凋亡细胞与CR3结合，单核细胞释放相似的囊泡。TGF-β1运输囊泡下调全血细胞的炎症，并放大内皮细胞的抗炎反应。因此，白色念珠菌可通过诱导TGF-β1囊泡的产生而减少宿主中促炎性细胞因子的早期诱导。

作者假设这种促炎反应的早期抑制发生在肠道中，响应微生物组，但这种抑制对全身感染的宿主是有害的。由于念珠菌病具有很高的死亡率，因此本研究可能为白色念珠菌感染提供治疗干预，并且还建议测试使用可溶性β-葡聚糖来抑制炎症性疾病的免疫。

相关阅读